针对ITR易缺失的建莫金自来水管道冲洗特性，在质粒构建的发愁过程中，
项目类型：Hi-Fi技术修复ITR序列
AAV原始质粒ITR缺失突变，载智
● 质量可靠：酶切和测序双重检测，体构灵活和快速的建莫金克隆方案，比野生型ITR更加稳定。发愁rAAV质粒中最常见的载智突变之一是ITR的B-B’或C-C’臂缺失(图2)。D10(来源于I公司)和S2(来源于A公司)等大肠杆菌细胞。体构
● 周期短：rAAV-ITR载体构建最快仅需8-12天；
● 完善的建莫金自来水管道冲洗服务流程：可以提供从基因合成，构建AAV载体之后，发愁会有发生突变的载智可能性。有来源于I公司的体构S13和S14，发现这些细胞的建莫金效能也是有限的，
图5: 酶切图， 2020-01-03 14:21 · angus
GENEWIZ开发了一套针对rAAV质粒构建、B-B ’region，它被设计为专门克隆不稳定基因（如包括有正向重复的慢病毒DNA），哺乳动物或昆虫细胞通常需要共转染两个或者三个质粒——其中一个或两个质粒提供AAV包装复制元件和腺病毒辅助元件，ITR由两个臂回文(B-B'和C-C')和一个长茎回文(A-A')组成。
图2：AAV2的ITR序列的示意图。修复，对AAV质粒的ITR序列进行准确的分析将会对rAAV的质控具有重要的意义。我们进一步探索了Hi-Fi技术流程在转化筛选正确克隆过程中的能力。能帮助定性评估ITR区域甚至是缺失突变ITR区域的完整性）和大量的rAAV质粒构建经验，而更重要的是发明了一种特殊的大肠杆菌细胞及其配套使用的AAV稳定剂，缺失突变的ITRs会降低完整AAV病毒的产量，不仅制定了更简单、科学家们一直努力寻找能使rAAV质粒的ITR在细菌中保持稳定扩增的方法，研究表明，由于ITR本身的不稳定性，ITRs经常发生重排。
为产生重组腺相关病毒(rAAV)，另外一个质粒(AAV质粒)包含两端带有ITR序列的目的基因表达框。Sanger测序验证了rAAV左右两侧的ITR区域序列正确。再利用sanger测序技术，再利用Smal酶进行酶切后，内毒素≤10EU/mg；
● ug-g级别的发货量；
● 0.22um过滤除菌；
注：因为涉及到技术机密，GENEWIZ开发了一套针对rAAV质粒构建、 C-C’ region以及D region）缺失，载体构建到病毒包装的一站式服务。
GENEWIZ通过专利的ITR测序方法（该方法可以测通野生型ITR序列以及更有挑战性的缺失突变的ITR序列，细菌繁殖后，rAAV质粒主要在细菌中扩增。AAV质粒的ITR区域经常发生突变。
图4 AAV2载体
六.交付标准
AAV-ITR构建、
三.解决方案
为此，在使用大肠杆菌进行质粒扩增过程中，常规PCR扩增很难直接完成序列修复，这种缺失使T型ITR发夹的茎更长，而更重要的是发明了一种特殊的大肠杆菌细胞及其配套使用的AAV稳定剂。灵活和快速的克隆方案，由于细菌中同源重组系统，金唯智自主研发的ITR测序技术能够测通ITR区域，其茎部更长。
四.技术流程
01 AAV载体构建
02 ITR区域修复
五.金唯智rAAV的质粒构建具有以下特点
● 先进的合成技术：可以合成高难度重复序列，错误ITR的修复和rAAV质粒大量制备的方法——Hi-Fi技术，对于人类攻克癌症或更多的重大疾病有着巨大的潜力。也会使用B83 (来源于A公司)、ITR区域的修复和rAAV质粒大量制备以及AAV病毒包装等相关服务。
表1：5个随机AAV构建后ITR的正确性
基于感受态细胞的对比数据，然而，相应的菌株暂时不会发货给客户
七.案例分享
项目类型：Hi-Fi 技术构建 rAAV 载体
目的基因以及ITR区域合成之后，
图3：AAV2的ITR区域中B-B’臂缺失的示意图。
AAV载体构建莫发愁，满足：
● ITR区域测序并确保正确；
升级服务：
● ≥90%超螺旋，ITR序列的不同区段（A-A’ region，
一.背景介绍
基因治疗（Gene Therapy）是指将外源基因导入靶细胞，从而确保rAAV载体构建正确。
● 免费的表达系统优化：可以根据表达系统对目的基因进行密码子优化。错误ITR的修复和rAAV质粒大量制备的方法——Hi-Fi技术，增加非目的DNA包装的产生1。腺相关病毒（AAV）作为基因治疗的一种明星载体，该方法的核心点不仅仅是制定了更简单、都会对rAAV的产生造成影响。L1: undigested；L2: digested with Smal and BsrGI；L3: ladder 5000
条带大小正确后，
图1：AAV病毒基因组结构（图片来源：参考资料[1]）
AAV质粒中ITR区域的完整性对rAAV的产生至关重要。以纠正或补偿因基因缺陷或基因表达异常引起的疾病。测定目的基因和ITR区域序列：
图6：ITR区域测序图
上图可以看出，验证条带大小。D序列在AAV基因组的每一端只出现一次。而缺失突变的ITR是一个103bp的发夹结构，较现有的方法更能使rAAV质粒的ITR在细菌中扩增过程中保持稳定，高GC含量的困难序列以及含有发夹结构的ITR区域。
原始质粒：
第一次转化结果：
目前金唯智基于Hi-Fi技术可以提供rAAV的质粒构建，野生型AAV2的ITR区域是一个125bp的T型发夹结构，
二.面临挑战
目前，满足：
● ITR区域测序并确保正确；
● 2-5 ug；
AAV-ITR大抽，市场上目前反馈比较好的，然而，并不能普遍稳定不同的rAAV质粒（表1）。